Аффилиация
a Российский химико-технологический университет имени Д. И. Менделеева, Москва
Все права защищены ©Романова и др. Это статья с открытым доступом, распространяемая на условиях международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0. (
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), позволяет другим распространять, перерабатывать, исправлять и развивать произведение, даже в коммерческих целях, при условии указания автора произведения.
Аннотация
Растительное сырье – доступный и перспективный субстрат для получения индивидуальных ферментов и мультиэнзимных композиций разного назначения. Эффективными продуцентами для промышленного производства ферментных препаратов могут стать термофильные бактерии, поскольку их ферменты обладают рядом преимуществ – термоустойчивостью и химической стабильностью. Актуальным является поиск термофильных штаммов, способных продуцировать промышленно ценные ферменты с высоким выходом при использовании недорогих растительных субстратов. Цель исследования – изучить состав комплекса гидролитических ферментов термофильного штамма-продуцента протеаз Bacillus subtilis Кб.12.Гл.35 при культивировании на средах с компонентами растительного происхождения и выбрать перспективное сырье для синтеза термостабильных гидролаз, в частности протеаз, амилаз и гемицеллюлаз.
Объект исследования – термофильный штамм Кб.12.Гл.35, выделенный из образца компоста и идентифицированный методом секвенирования гена 16S рРНК как Bacillus subtilis. Для исследования состава комплекса гидролаз штамм выращивали на средах с растительной мукой в комбинации с дрожжевым или кукурузным экстрактом, оценивали активность внеклеточных ферментов. В качестве растительной муки в количестве 1 % использовали гороховую, льняную, нутовую, овсяную, рисовую, амарантовую, соевую, а также смесь на основе амарантовой и соевой муки. Активность протеаз определяли по казеину и на основе зимографического анализа, активность карбогидраз – методом с 3,5-динитросалициловой кислотой.
При культивировании продуцента гидролаз на питательных средах с растительной мукой (1 %) и кукурузным экстрактом (0,5 %) максимальный уровень синтеза протеаз (более 400 ед/мл) выявлен при использовании амарантовой, овсяной и рисовой муки; амилаз (более 1300 ед/мл) – нутовой, овсяной и рисовой муки; галактоманнаназ (более 200 ед/мл) и ксиланаз (более 60 ед/мл) – амарантовой, гороховой и нутовой; арабиногалактаназ (более 35 ед/мл) – амарантовой, нутовой и рисовой муки. По результатам зимографического анализа можно предположить, что наибольшую роль в протеолитической активности играют ферменты массой 24,7–28,2 кДа, а также протеазы массой 62,7–75,0 кДа, т. к. их активность ярко выражена при культивировании на растительном сырье, в отличие от стандартной среды LB. Секреция протеазы массой 15,1 кДа на сырье практически не отличалась от ее уровня на стандартной среде.
Термофильный штамм Кб.12.Гл.35 можно рассматривать в качестве перспективного продуцента для получения протеаз, амилаз и гемицеллюлаз при использовании в составе среды растительной муки и кукурузного экстракта. Дальнейшие исследования могут быть направлены на оптимизацию состава питательных сред и условий культивирования для повышения выхода целевой группы гидролитических ферментов.
Ключевые слова
Термофильные бактерии,
Bacillus,
протеазы,
амилазы,
растительное сырье,
зимография
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Mokrani S, Nabti EH. Recent status in production, biotechnological applications, commercial aspects, and future prospects of microbial enzymes: A comprehensive review. International Journal of Agricultural Science and Food Technology. 2024;10(1):006–020. https://doi.org/10.17352/2455-815x.000202
- Tripathi P, Sinha S. Industrial biocatalysis: An insight into trends and future directions. Current Sustainable/Renewable Energy Reports. 2020;7:66–72. https://doi.org/10.1007/s40518-020-00150-8
- Meghwanshi GK, Kaur N, Verma S, Dabi NK, Vashishtha A, et al. Enzymes for pharmaceutical and therapeutic applications. Biotechnology and Applied Biochemistry. 2020;67(4):586–601. https://doi.org/10.1002/bab.1919
- Shukla P. Synthetic biology perspectives of microbial enzymes and their innovative applications. Indian Journal of Microbiology. 2019;59(4):401–409. https://doi.org/10.1007/s12088-019-00819-9
- Singh RS, Singh T, Pandey A. Microbial enzymes–An overview. In: Singh RS, Singhania RR, Pandey A, Larroche C, editors. Advances in Enzyme Technology. MA: Elsevier; 2019. pp. 1–40. https://doi.org/10.1016/B978-0-444-64114-4.00001-7
- Zhang Y, Geary T, Simpson BK. Genetically modified food enzymes: A review. Current Opinion in Food Science. 2019;25:14–18. https://doi.org/10.1016/j.cofs.2019.01.002
- Burkhardt C, Baruth L, Meyer-Heydecke N, Klippel B, Margaryan A, et al. Mining thermophiles for biotechnologically relevant enzymes: Evaluating the potential of European and Caucasian hot springs. Extremophiles. 2023;28:5. https://doi.org/10.1007/s00792-023-01321-3
- Thapa S, Li H, OHair J, Bhatti S, Chen F-C, et al. Biochemical characteristics of microbial enzymes and their significance from industrial perspectives. Molecular Biotechnology. 2019;61:579–601. https://doi.org/10.1007/s12033-019-00187-1
- Atalah J, Cáceres-Moreno P, Espina G, Blamey JM. Thermophiles and the applications of their enzymes as new biocatalysts. Bioresource Technology. 2019;280:478–488. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.02.008
- Kumar S, Dangi AK, Shukla P, Baishya D, Khare SK. Thermozymes: Adaptive strategies and tools for their biotechnological applications. Bioresource Technology. 2019;278:372–382. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.01.088
- Han H, Ling Z, Khan A, Virk AK, Kulshrestha S, et al. Improvements of thermophilic enzymes: From genetic modifications to applications. Bioresource Technology. 2019;279:350–361. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.01.087
- Ajeje SB, Hu Y, Song G, Peter SB, Afful RG, et al. Thermostable cellulases / Xylanases from thermophilic and hyperthermophilic microorganisms: Current perspective. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2021;9:794304. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.794304
- Verma J, Sourirajan A, Dev K. Bacterial diversity in 110 thermal hot springs of Indian Himalayan Region (IHR). 3 Biotech. 2022;12:238. https://doi.org/10.1007/s13205-022-03270-8
- Finore I, Feola A, Russo L, Cattaneo A, di Donato P, et al. Thermophilic bacteria and their thermozymes in composting processes: A review. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2023;10:7. https://doi.org/10.1186/s40538-023-00381-z
- Romanova MV, Dolbunova AN, Epishkina YuM, Evdokimova SA, Kozlovskiy MR, et al. A thermophilic L-lactic acid producer of high optical purity: Isolation and identification. Foods and Raw Materials. 2024;12(1):101–109. https://doi.org/10.21603/2308-4057-2024-1-591
- Kambourova M. Thermostable enzymes and polysaccharides produced by thermophilic bacteria isolated from Bulgarian hot springs. Engineering in Life Sciences. 2018;18(11):758–767. https://doi.org/10.1002/elsc.201800022
- Liang Q, Zhan Y, Yuan M, Cao L, Zhu C, et al. Improvement of the catalytic ability of a thermostable and acidophilic β-mannanase using a consensus sequence design strategy. Frontiers in Microbiology. 2021;12:722347. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.722347
- Tan S, Tao X, Zheng P, Chen P, Yu X, et al. Thermostability modification of β-mannanase from Aspergillus niger via flexibility modification engineering. Frontiers in Microbiology. 2023;14:1119232. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1119232
- Solanki P, Putatunda C, Kumar A, Bhatia R, Walia A. Microbial proteases: Ubiquitous enzymes with innumerable uses. 3 Biotech. 2021;11:428. https://doi.org/10.1007/s13205-021-02928-z
- Herrera-Márquez O, Fernández-Serrano M, Pilamala M, Jácome MB, Luzón G. Stability studies of an amylase and a protease for cleaning processes in the food industry. Food and Bioproducts Processing. 2019;117:64–73 https://doi.org/10.1016/j.fbp.2019.06.015
- Velázquez-De Lucio BS, Hernández-Domínguez E, Villa-García M, Díaz-Godínez G, Mandujano-González V, et al. Exogenous enzymes as zootechnical additives in animal feed: A review. Catalysts. 2021;11(7):851. https://doi.org/10.3390/catal11070851
- Nagarajan DR, Krishnan C. Use of a new catabolite repression resistant promoter isolated from Bacillus subtilis KCC103 for hyper-production of recombinant enzymes. Protein Expression and Purification. 2010;70(1):122–128. https://doi.org/10.1016/j.pep.2009.09.020
- Xiao F, Li Y, Zhang Y, Wang H, Zhang L, et al. A new CcpA binding site plays a bidirectional role in carbon catabolism in Bacillus licheniformis. iScience. 2021;24(5):102400. https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.102400
- Sun B, Zou K, Zhao Y, Tang Y, Zhang F, et al. The fermentation optimization for alkaline protease production by Bacillus subtilis BS-QR-052. Frontiers in Microbiology. 2023;14:1301065. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1301065
- Naik B, Kumar V, Rizwanuddin S, Chauhan M, Gupta AK, et al. Agro-industrial waste: A cost-effective and eco-friendly substrate to produce amylase. Food Production, Processing and Nutrition. 2023;5:30. https://doi.org/10.1186/s43014-023-00143-2
- Bhange K, Chaturvedi V, Bhatt R. Simultaneous production of detergent stable keratinolytic protease, amylase and biosurfactant by Bacillus subtilis PF1 using agro industrial waste. Biotechnology Reports. 2016;10:94–104. https://doi.org/10.1016/j.btre.2016.03.007
- Su Y, Liu C, Fang H, Zhang D. Bacillus subtilis: A universal cell factory for industry, agriculture, biomaterials and medicine. Microbial Cell Factories. 2020;19:173. https://doi.org/10.1186/s12934-020-01436-8
- Baweja M, Tiwari R, Singh PK, Nain L, Shukla P. An alkaline protease from Bacillus pumilus MP 27: Functional analysis of its binding model toward its applications as detergent additive. Frontiers in Microbiology. – 2016;7:01195. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01195
- Abd-Elhalim BT, Gamal RF, El-Sayed SM, Abu-Hussien SH. Optimizing alpha-amylase from Bacillus amyloliquefaciens on bread waste for effective industrial wastewater treatment and textile desizing through response surface methodology. Scientific Reports. 2023;13:19216. https://doi.org/10.1038/s41598-023-46384-6
- Devi S, Dwivedi D, Bhatt AK. Utilization of agroresidues for the production of xylanase by Bacillus safensis XPS7 and optimization of production parameters. Fermentation. 2022;8(5):221. https://doi.org/10.3390/fermentation8050221
- Srivastava PK, Kapoor M. Cost-effective endo-mannanase from Bacillus sp. CFR1601 and its application in generation of oligosaccharides from guar gum and as detergent additive. Preparative Biochemistry & Biotechnology. 2014;44(4):392–417. https://doi.org/10.1080/10826068.2013.833108
- Романова М. В., Кузнецов А. Е., Белодед А. В. Молекулярно-биологическая и биохимическая характеристика внеклеточных протеаз термофильных бактериальных штаммов. Бутлеровские сообщения. 2021. Т. 68. № 12. С. 103–111. https://elibrary.ru/LBSMNK
- de Vos P, Garrity GM, Jones D, Krieg NR, Ludwig W, et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition, Vol. 3. NY: Springer; 2009. pp. 21–128. https://doi.org/10.1007/978-0-387-68489-5_3
- Tamura K, Stecher G, Kumar S. MEGA11: Molecular evolutionary genetics analysis version 11. Molecular Biology and Evolution. 2021;38(7):3022–3027. https://doi.org/10.1093/molbev/msab120
- Oliver GW, Stetler-Stevenson WG, Kleiner DE. Zymography, casein zymography, and reverse zymography: Activity assays for proteases and their inhibitors. In: Sterchi EE, Stöcker W, editors. Proteolytic enzymes. Berlin: Springer Lab Manual; 1999. pp. 63–76. https://doi.org/10.1007/978-3-642-59816-6_5
- Гольдштейн В., Лукин Н., Радин О. Кукурузный экстракт в кормах. Комбикорма. 2022. № 3. С. 45–46. https://doi.org/10.25741/2413-287X-2022-03-3-170
- Harwood CR, Kikuchi Y. The ins and outs of Bacillus proteases: Activities, functions and commercial significance. FEMS Microbiology Reviews. 2022;46(1):fuab046. https://doi.org/10.1093/femsre/fuab046
- Al-Attar H, Ahmed J, Thomas L. Rheological, pasting and textural properties of corn flour as influenced by the addition of rice and lentil flour. LWT. 2022;160:113231. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2022.113231
- Filipović J, Ivkov M, Košutić M, Filipović V. Ratio of omega-6/omega-3 fatty acids of spelt and flaxseed pasta and consumer acceptability. Czech Journal of Food Sciences. 2016;34(6):522–529. https://doi.org/10.17221/384/2015-CJFS
- Agume ASN, Njintang NY, Mbofung CMF. Effect of soaking and roasting on the physicochemical and pasting properties of soybean flour. Foods. 2017;6(2):12. https://doi.org/10.3390/foods6020012
- Malik M, Sindhu R, Dhull SB, Bou-Mitri C, Singh Y, et al. Nutritional composition, functionality, and processing technologies for amaranth. Journal of Food Processing and Preservation. 2023;2023(1):1753029. https://doi.org/10.1155/2023/1753029
- Noguchi M, Hasegawa Y, Suzuki S, Nakazawa M, Ueda M, et al. Determination of chemical structure of pea pectin by using pectinolytic enzymes. Carbohydrate Polymers. 2020;231:115738. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2019.115738
- Karki B, Maurer D, Kim TH, Jung S. Comparison and optimization of enzymatic saccharification of soybean fibers recovered from aqueous extractions. Bioresource Technology. 2011;102(2):1228–1233. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2010.08.004
- Hsiao H-Y, Anderson DM, Dale NM. Levels of β-mannan in soybean meal. Poultry Science. 2006;85(8):1430–1432. https://doi.org/10.1093/ps/85.8.1430
- Ray S, Paynel F, Morvan C, Lerouge P, Driouich A, et al. Characterization of mucilage polysaccharides, arabinogalactanproteins and cell-wall hemicellulosic polysaccharides isolated from flax seed meal: A wealth of structural moieties. Carbohydrate Polymers. 2013;93(2):651–660. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2012.12.034
- Yan F, Tian S, Chen H, Gao S, Dong X, et al. Advances in xylooligosaccharides from grain byproducts: Extraction and prebiotic effects. Grain & Oil Science and Technology. 2022;5(2):98–106. https://doi.org/10.1016/j.gaost.2022.02.002
- Xie F, Feng F, Liu D, Quan S, Liu L, et al. Bacillus amyloliquefaciens 35M can exclusively produce and secrete proteases when cultured in soybean-meal-based medium. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2022;209(Part 2):112188. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2021.112188
- Wu XC, Nathoo S, Pang A, Carne T, Wong S. Cloning, genetic organization, and characterization of a structural gene encoding bacillopeptidase F from Bacillus subtilis. The Journal of Biological Chemistry. 1990;265(12):6845–6850. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(19)39225-7
- Ning Y, Yang H, Weng P, Wu Z. Analysis and identification of the extracellular proteases from Bacillus velezensis SW5. Applied Biochemistry and Microbiology. 2021;57:S27–S37 https://doi.org/10.1134/S0003683821100082
- Yoo JY, Yao Z, Lee SJ, Jeon HS, Kim JH. Cloning and expression of a fibrinolytic enzyme gene, aprECJ1, from Bacillus velezensis CJ1 isolated from Myeolchi Jeotgal. Microbiology and Biotechnology Letters. 2021;49(3):289–297. https://doi.org/10.48022/mbl.2104.04012