Аннотация

Несмотря на востребованность в молекулярной диагностике, выделение бактериальной ДНК из молочных продуктов остается малоизученной областью. Актуальность работы обусловлена необходимостью оценки эффективности методов экстракции ДНК для обнаружения микроорганизмов в пищевых матрицах. Цель исследования – провести сравнительный анализ методов экстракции бактериальной ДНК из козьего молока и продуктов его переработки.
Объекты исследования – сырое, пастеризованное и сухое козье молоко, а также кисломолочный продукт на йогуртовой закваске (йогурт) и сыр на основе козьего молока. Нуклеиновые кислоты из молока и молочных продуктов выделяли с использованием 5 коммерчески доступных наборов, основанных на применении кремнеземного сорбента (ДНК-Сорб-С-М), солевого осаждения нуклеиновых кислот (ДНК-Экстран-2), спин-колонок с кремниевым фильтром (К-Сорб), магнитных частиц (ГМО-МагноСорб), комбинации фенол-хлороформной экстракции и кремниевого сорбента (Сорб-ГМО-Б). Анализ концентрации и чистоты препаратов ДНК проводили флуори- и спектрометрическим методами. Выделенная суммарная ДНК использовалась в качестве матрицы для амплификации фрагментов бактериальных генов 16S рРНК.
Все наборы эффективно выделяли бактериальную ДНК из молочных продуктов, за исключением образцов сухого молока. Возможно, отсутствие амплификации в данных образцах было связано с технологическими особенностями производства или деградацией ДНК во время экстракции. Лучшие результаты показал метод с фенол-хлороформной экстракцией и кремниевым сорбентом, особенно для сложных матриц. Метод с кремнеземным сорбентом без органических растворителей занял второе место по эффективности. Анализ выхода и чистоты бактериальной ДНК, полученной различными методами экстракции, показал, что не все из них оказывались эффективными при работе с молочными матрицами.
Проведенные исследования позволили заключить, что наиболее продуктивным и универсальным методом экстракции ДНК из козьего молока и продуктов его переработки оказался метод фенол-хлороформной экстракции с адсорбцией на кремниевом сорбенте. Эффективность использования любого протокола может быть улучшена путем его адаптации к особенностям анализируемого продукта с учетом его вязкости, плотности, содержания бактериальных клеток, наличия или отсутствия сложных белковых, экзополисахаридных или жировых матриц, в которых заключены микроорганизмы и т. д.

Ключевые слова

Молекулярно-генетические методы, ПЦР, методы выделения ДНК, нуклеиновая кислота, молочные продукты, козье молоко

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания по направлению FNSS-2025-0002 «Развить методологические основы мониторинга молочной продукции с элементами кластеризационной идентификации, формирующей гибкую аналитическую систему оценки в условиях глобальной прослеживаемости» на базе ФГАНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности».

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ход достижения целей в области устойчивого развития. Организация Объединенных Наций. Генеральная Ассамблея Экономический и Социальный совет. Available from: https://unstats.un.org/sdgs/files/report/2024/secretary-general-sdg-report-2024--RU.pdf
2. Grosso G, Mateo A, Rangelov N, Buzeti T, Birt C. Nutrition in the context of the sustainable development goals. European Journal of Public Health. 2020;30(1):i19–i23. https://doi.org/10.1093/eurpub/ckaa034
3. Dairy’s impact on reducing global hunger. IFCN Dairy Research Network. [cited 2024 Oct 03]. Available from: https://ifcndairy.org/dairys-impact-on-reducing-global-hunger/
4. Глазунова О. А., Моисеенко К. В., Бегунова А. В., Рожкова И. В., Федорова Т. В. Функциональные свойства и особенности генома заквасочных пробиотических культур лактобактерий. Актуальная биотехнология. 2022. № 1. С. 73–77. https://elibrary.ru/SLTOBG
5. Юрова Е. А., Фильчакова С. А., Жижин Н. А. Применение метода ПЦР-анализа для определения видового состава молочного сырья. Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2020. № 6. С. 16–25. https://doi.org/10.26897/0021-342X-2020-6-16-25
6. Юрова Е. А., Жижин Н. А., Фильчакова С. А. Применение молекулярно-генетических методов анализа для идентификации видовой принадлежности сырьевого состава пищевой продукции. Вестник МГТУ. 2020. Т. 23. № 3. С. 214–223. https://elibrary.ru/HUZYAY
7. Лазарева Е. Г., Хан А. В., Фоменко О. Ю. Исследование методов экстракции ДНК из сырого молока. Молочная промышленность. 2023. № 5. С. 115–116. https://doi.org/10.21603/1019-8946-2023-5-8
8. Usman T, Yu Y, Liu C, Fan Z, Wang Y. Comparison of methods for high quantity and quality genomic DNA extraction from raw cow milk. Genetics and Molecular Research. 2014;13(2):3319–3328. https://doi.org/10.4238/2014.April.29.10
9. Benitez-Velásquez M, Cabrera R, Ríos-Tobón S, Isaza JP, Gutiérrez LA. Assessment of four different DNA extraction methodologies for the molecular detection of phage λ and Bacillus sp. in raw bovine milk samples. International Dairy Journal. 2024;151:105862. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2023.105862
10. Abdelhamed MFM, Zaid RH, Ibrahim MT, Almansoori AE. Magnetic beads carried over in extracted DNA elution from mastitis cow milk. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2024;13(1):73–80. https://doi.org/10.20546/ijcmas.2024.1301.009
11. d’Angelo F, Santillo A, Sevi A, Albenzio M. Technical note: A simple salting-out method for DNA extraction from milk somatic cells: Investigation into the goat CSN1S1 gene. Journal of Dairy Science. 2007;90(7):3550–3552. https://doi.org/10.3168/jds.2007-0149
12. Liu YF, Gao JL, Yang YF, Ku T, Zan LS. Novel extraction method of genomic DNA suitable for long-fragment amplification from small amounts of milk. Journal of Dairy Science. 2014;97(11):6804–6809. https://doi.org/10.3168/jds.2014-8066
13. Amills M, Francino O, Jansa M, Sanchez A. Isolation of genomic DNA from milk samples by using Chelex resin. Journal of Dairy Research. 1997;64(2):231–238. https://doi.org/10.1017/s0022029997002161
14. Goat milk product market overview, 2023–28. Research and Markets. The World’s Largest Market Research Store. [cited 2024 Oct 03]. Available from: https://www.researchandmarkets.com/reports/5853411/goat-milk-product-market-overview-28d
15. ALKaisy QH, Al‐Saadi JS, Al‐Rikabi AKJ, Altemimi AB, Hesarinejad MA, et al. Exploring the health benefits and functional properties of goat milk proteins. Food Science & Nutrition. 2023;11(10):5641–5656. https://doi.org/10.1002/fsn3.3531
16. Marsh AJ, O'Sullivan O, Hill C, Ross RP, Cotter PD. Sequencing-based analysis of the bacterial and fungal composition of kefir grains and milks from multiple sources. PLOS One. 2013;8(7):e69371. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069371
17. Bhoyar L, Mehar P, Chavali K. An overview of DNA degradation and its implications in forensic caseworks. Egyptian Journal of Forensic Sciences. 2024;14:15. https://doi.org/10.1186/s41935-024-00389-y
18. Хан А. В., Коваль Д. Д., Лазарева Е. Г., Фоменко О. Ю. Сравнительный анализ симплексной и дуплексной ПЦР для выявления фальсификации козьего молока и продуктов его термической обработки. Food Metaengineering. 2024. Т. 2. № 3. С. 12–24. https://doi.org/10.37442/fme.2024.3.63
19. Huang X, Duan N, Xu H, Xie TN, Xue YR, и др. Выделение ДНК из грибов с высоким содержанием полисахаридов с использованием CTAB-PEG. Молекулярная биология. 2018. Т. 52. № 4. С. 718–726. https://doi.org/10.1134/S0026898418040080
20. Lick S, Keller M, Bockelmann W, Heller KJ. Optimized DNA extraction method for starter cultures from yoghurt. Milchwissenschaft. 1995;51(4):183–186.