Аффилиация
a Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности, Москва
Все права защищены ©Коваль и др. Это статья с открытым доступом, распространяемая на условиях международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0. (
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), позволяет другим распространять, перерабатывать, исправлять и развивать произведение, даже в коммерческих целях, при условии указания автора произведения.
Аннотация
Несмотря на востребованность в молекулярной диагностике, выделение бактериальной ДНК из молочных продуктов остается малоизученной областью. Актуальность работы обусловлена необходимостью оценки эффективности методов экстракции ДНК для обнаружения микроорганизмов в пищевых матрицах. Цель исследования – провести сравнительный анализ методов экстракции бактериальной ДНК из козьего молока и продуктов его переработки.
Объекты исследования – сырое, пастеризованное и сухое козье молоко, а также кисломолочный продукт на йогуртовой закваске (йогурт) и сыр на основе козьего молока. Нуклеиновые кислоты из молока и молочных продуктов выделяли с использованием 5 коммерчески доступных наборов, основанных на применении кремнеземного сорбента (ДНК-Сорб-С-М), солевого осаждения нуклеиновых кислот (ДНК-Экстран-2), спин-колонок с кремниевым фильтром (К-Сорб), магнитных частиц (ГМО-МагноСорб), комбинации фенол-хлороформной экстракции и кремниевого сорбента (Сорб-ГМО-Б). Анализ концентрации и чистоты препаратов ДНК проводили флуори- и спектрометрическим методами. Выделенная суммарная ДНК использовалась в качестве матрицы для амплификации фрагментов бактериальных генов 16S рРНК.
Все наборы эффективно выделяли бактериальную ДНК из молочных продуктов, за исключением образцов сухого молока. Возможно, отсутствие амплификации в данных образцах было связано с технологическими особенностями производства или деградацией ДНК во время экстракции. Лучшие результаты показал метод с фенол-хлороформной экстракцией и кремниевым сорбентом, особенно для сложных матриц. Метод с кремнеземным сорбентом без органических растворителей занял второе место по эффективности. Анализ выхода и чистоты бактериальной ДНК, полученной различными методами экстракции, показал, что не все из них оказывались эффективными при работе с молочными матрицами.
Проведенные исследования позволили заключить, что наиболее продуктивным и универсальным методом экстракции ДНК из козьего молока и продуктов его переработки оказался метод фенол-хлороформной экстракции с адсорбцией на кремниевом сорбенте. Эффективность использования любого протокола может быть улучшена путем его адаптации к особенностям анализируемого продукта с учетом его вязкости, плотности, содержания бактериальных клеток, наличия или отсутствия сложных белковых, экзополисахаридных или жировых матриц, в которых заключены микроорганизмы и т. д.
Ключевые слова
Молекулярно-генетические методы,
ПЦР,
методы выделения ДНК,
нуклеиновая кислота,
молочные продукты,
козье молоко
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Ход достижения целей в области устойчивого развития. Организация Объединенных Наций. Генеральная Ассамблея Экономический и Социальный совет. Available from: https://unstats.un.org/sdgs/files/report/2024/secretary-general-sdg-report-2024--RU.pdf
- Grosso G, Mateo A, Rangelov N, Buzeti T, Birt C. Nutrition in the context of the sustainable development goals. European Journal of Public Health. 2020;30(1):i19–i23. https://doi.org/10.1093/eurpub/ckaa034
- Dairy’s impact on reducing global hunger. IFCN Dairy Research Network. [cited 2024 Oct 03]. Available from: https://ifcndairy.org/dairys-impact-on-reducing-global-hunger/
- Глазунова О. А., Моисеенко К. В., Бегунова А. В., Рожкова И. В., Федорова Т. В. Функциональные свойства и особенности генома заквасочных пробиотических культур лактобактерий. Актуальная биотехнология. 2022. № 1. С. 73–77. https://elibrary.ru/SLTOBG
- Юрова Е. А., Фильчакова С. А., Жижин Н. А. Применение метода ПЦР-анализа для определения видового состава молочного сырья. Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2020. № 6. С. 16–25. https://doi.org/10.26897/0021-342X-2020-6-16-25
- Юрова Е. А., Жижин Н. А., Фильчакова С. А. Применение молекулярно-генетических методов анализа для идентификации видовой принадлежности сырьевого состава пищевой продукции. Вестник МГТУ. 2020. Т. 23. № 3. С. 214–223. https://elibrary.ru/HUZYAY
- Лазарева Е. Г., Хан А. В., Фоменко О. Ю. Исследование методов экстракции ДНК из сырого молока. Молочная промышленность. 2023. № 5. С. 115–116. https://doi.org/10.21603/1019-8946-2023-5-8
- Usman T, Yu Y, Liu C, Fan Z, Wang Y. Comparison of methods for high quantity and quality genomic DNA extraction from raw cow milk. Genetics and Molecular Research. 2014;13(2):3319–3328. https://doi.org/10.4238/2014.April.29.10
- Benitez-Velásquez M, Cabrera R, Ríos-Tobón S, Isaza JP, Gutiérrez LA. Assessment of four different DNA extraction methodologies for the molecular detection of phage λ and Bacillus sp. in raw bovine milk samples. International Dairy Journal. 2024;151:105862. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2023.105862
- Abdelhamed MFM, Zaid RH, Ibrahim MT, Almansoori AE. Magnetic beads carried over in extracted DNA elution from mastitis cow milk. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2024;13(1):73–80. https://doi.org/10.20546/ijcmas.2024.1301.009
- d’Angelo F, Santillo A, Sevi A, Albenzio M. Technical note: A simple salting-out method for DNA extraction from milk somatic cells: Investigation into the goat CSN1S1 gene. Journal of Dairy Science. 2007;90(7):3550–3552. https://doi.org/10.3168/jds.2007-0149
- Liu YF, Gao JL, Yang YF, Ku T, Zan LS. Novel extraction method of genomic DNA suitable for long-fragment amplification from small amounts of milk. Journal of Dairy Science. 2014;97(11):6804–6809. https://doi.org/10.3168/jds.2014-8066
- Amills M, Francino O, Jansa M, Sanchez A. Isolation of genomic DNA from milk samples by using Chelex resin. Journal of Dairy Research. 1997;64(2):231–238. https://doi.org/10.1017/s0022029997002161
- Goat milk product market overview, 2023–28. Research and Markets. The World’s Largest Market Research Store. [cited 2024 Oct 03]. Available from: https://www.researchandmarkets.com/reports/5853411/goat-milk-product-market-overview-28d
- ALKaisy QH, Al‐Saadi JS, Al‐Rikabi AKJ, Altemimi AB, Hesarinejad MA, et al. Exploring the health benefits and functional properties of goat milk proteins. Food Science & Nutrition. 2023;11(10):5641–5656. https://doi.org/10.1002/fsn3.3531
- Marsh AJ, O'Sullivan O, Hill C, Ross RP, Cotter PD. Sequencing-based analysis of the bacterial and fungal composition of kefir grains and milks from multiple sources. PLOS One. 2013;8(7):e69371. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069371
- Bhoyar L, Mehar P, Chavali K. An overview of DNA degradation and its implications in forensic caseworks. Egyptian Journal of Forensic Sciences. 2024;14:15. https://doi.org/10.1186/s41935-024-00389-y
- Хан А. В., Коваль Д. Д., Лазарева Е. Г., Фоменко О. Ю. Сравнительный анализ симплексной и дуплексной ПЦР для выявления фальсификации козьего молока и продуктов его термической обработки. Food Metaengineering. 2024. Т. 2. № 3. С. 12–24. https://doi.org/10.37442/fme.2024.3.63
- Huang X, Duan N, Xu H, Xie TN, Xue YR, и др. Выделение ДНК из грибов с высоким содержанием полисахаридов с использованием CTAB-PEG. Молекулярная биология. 2018. Т. 52. № 4. С. 718–726. https://doi.org/10.1134/S0026898418040080
- Lick S, Keller M, Bockelmann W, Heller KJ. Optimized DNA extraction method for starter cultures from yoghurt. Milchwissenschaft. 1995;51(4):183–186.