Аннотация

Представлены результаты научно-исследовательской работы по изучению способности казеиновых фосфопептидов солюбилизировать двухвалентное железо в бактериальном концентрате пропионовокислых бактерий. Определены оптимальные технологические параметры выделения казеиновых фосфопептидов. Установлена взаимосвязь между концентрацией железа и степенью солюбилизации. Отмечено, что железо, хелатированное казеиновыми фосфопептидами, сохраняется в двухвалентной форме в течение длительного срока хранения.

Ключевые слова

Казеиновые фосфопептиды, пропионовокислые бактерии, сульфат железа, солюбилизация

ВВЕДЕНИЕ

Концепция оптимального питания предполагает в качестве одного из важнейших условий сохранения здоровья человека адекватную обеспеченность его организма как макро-, так и микронутриентами, в том числе и эссенциальными микроэлементами, в частности железом. Железодефицитные состояния по-преж-нему остаются актуальной и во многих отношениях не решенной проблемой современной медицины. Недостаток железа в организме приводит ко многим негативным последствиям. Одним из них является развитие железодефицитной анемии [1]. Учитывая, что в повседневной жизни человек потребляет железо в составе растительных и животных продуктов и наличие аминокислот и пептидов, а также белков животного происхождения способствует лучшему усвоению организмом этого микроэлемента, представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами железа. По нашему мнению, наиболее удобным объектом для биотехнологического получения железа в органической форме являются пропионовокислые бактерии, которые обладают способностью синтезировать значительное количество гемсодержащих ферментов и корриноидов, повышающих усвоение железа [2]. Известно, что железо в организме может всасываться только в виде Fe2+. Однако двухвалентное железо подвергается быстрому химическому окислению, переходя в нерастворимую, неусвояемую организмом трехвалентную форму. Для сохранения биодоступности железа привлекательной представляется роль хелатирующих «агентов», которые способствуют солюбилизации минералов, сохраняя их в растворимом состоянии. Одним из представителей такого рода хелаторов являются казеиновые фосфопептиды (СРРs). СРРs - это фосфолированные пептиды, образующиеся из казеинов коровьего молока при их переваривании пищеварительными протеиназами [3]. Следует отметить, что до сих пор казеиновые фосфопептиды недостаточно изучены и как хелатирующие «агенты» для минералов, и как потенциальные нутрицевтики в питании человека. Кроме того, в литературе отсутствуют данные о влиянии СРРs на солюбилизацию железа. Поэтому исследование железосвязывающей способности СРРs представляет большой интерес. Целью настоящей работы являлось исследование способности казеиновых фосфопептидов солюбилизировать двухвалентное железо в бактериальном концентрате пропионовокислых бактерий. Объектом исследования служили культуры пропионовокислых бактерий (ПБК): штаммы Propionibacterium freudenrichii subsp. shermanii АС-2503, Propionibacterium freudemrichii subsp. fredenreichii АС-2500, Propionibacterium cyclohexanicum Kusano АС-2260 и Propionibacterium cyclohexanicum Kusano АС-2259, полученные из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (Москва), активизированные уникальным биотехнологическим способом, разработанным в Восточно-Сибирском государственном технологическом университете. Культивирование пропионовокислых бактерий осуществляли на сывороточной среде с добавлением ростовых факторов [4]. В качестве источника железа использовали двухвалентную соль (FeSO4). Сульфат железа добавляли в ростовую среду в концентрации 0,25-0,55 мг/мл. Культивирование пропионовокислых бактерий в присутствии сульфата железа осуществляли в течение 24 часов при температуре 30оС. Известно, что биологический эффект взаимодействия микроорганизмов с металлами определяется концентрацией металла, степенью его токсичности и метаболическим потенциалом микроорганизмов. При проведении экспериментальных исследований нами было отмечено, что сульфат железа до определенной концентрации (0,25 мг/мл для P. freudemrichii subsp. fredenreichii АС-2500 и 0,35 мг/мл для всех остальных штаммов) повышает удельную скорость роста пропионовокислых бактерий, что свидетельствует о необходимости железа для нормального метаболизма клетки [5]. Дальнейшее повышение концентрации FeSO4 в среде до 0,45 мг/мл и более приводит к изменению окраски концентратов и выпадению осадка, это указывает на образование нерастворимых Fe3+ ионов. В связи с этим изучали влияние казеиновых фосфопептидов (СРРs) на солюбилизацию (хелатирование) железа в бактериальном концентрате пропионовокислых бактерий. В настоящее время разрабатываются пероральные формы пептидных препаратов с различной направленностью фармакологического действия. Однако созданию таких форм препятствует низкая устойчивость пептидов к действию ферментов желудка и тонкой кишки [6]. В отличие от многих биологически активных пептидов СРРs проявляют высокую устойчивость к гидролитическому действию пищеварительных протеиназ и пептидаз, что делает эффективным их пероральное применение. Казеиновые фосфопептиды являются биологически активными веществами естественного природного происхождения, поэтому более предпочтительны для организма, так как действуют гораздо мягче и более длительно. Их основная биологическая активность (способность обеспечивать коллоидное состояние кальцийфосфатного комплекса в молоке с последующим поддержанием его в растворенном состоянии в полости тонкой кишки) генетически детерменирована для облегчения утилизации организмом Са и Р. Поэтому использование СРРs в комплексе с минеральными добавками позволит достаточно легко и быстро восполнить дефицит того или иного минерального элемента [7]. Известно, что металлосвязывающая способность СРРs зависит от степени фосфорилирования, которая, в свою очередь, связана с типом казеина и способом ферментативного гидролиза. Высокополярные кислые домены в структуре СРРs являются местами связывания минералов. Дефосфорилирование СРРs приводит к потери этой способности [8], и наоборот, химическое фосфорилирование αs1 - β - CN повышает их металлосвязываюшую емкость [9]. Согласно литературным данным в щелочной зоне казеиновые фосфопептиды могут связывать 24 и 17 молекул Са и Р соответственно [10]. Причем одна молекула СРРs способна связывать 40 молекул Са и 6 молекул Zn [11]. Хотя способность СРРs связывать минералы обусловлена присутствием в их структуре анионного гидрофильного участка, тем не менее, аминокислотные последовательности до и после этого участка также вносят значительный вклад в аффинность СРРs к минералам. Выделение СРРs включает стадию ферментативного гидролиза натриевого казеината панкреатическими протеиназами. Традиционные схемы выделения СРРs предлагают проводить такую ферментацию разными протеиназами, что приводит к расхождениям в аминограмме и, как следствие, к различным способностям связывать минералы. С целью получения гидролизата с максимальным содержанием низкомолекулярных фосфорилированных пептидов и свободных аминокислот, способных в дальнейшем образовывать комплексы с железом, нами были уточнены технологические параметры выделения СРРs. При получении казеиновых фосфопептидов применяли схему одностадийного гидролиза казеината Na с использованием пепсина и трипсина при разной продолжительности гидролиза. Изменение молекулярно-массового распределения пептидных фракций в готовых растворах СРРs в зависимости от времени гидролиза и концентрации используемых ферментов представлено в табл. 1. Из результатов, приведенных в табл. 1, видно, что при гидролизе натриевого казеината 3%-м пепсином уже через 120 мин достигается максимальное содержание низкомолекулярных (10,5-5,1 кД) структур - 18,7%. Дальнейшее увеличение продолжительности гидролиза не приводит к заметному изменению в содержании низкомолекулярных фракций. Таблица 1 Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций Время гидролиза, минДиапазон молекулярных масс, кДСодержание фракций (%) в диапазоне молекулярных масс, в зависимости от используемого фермента Пепсин 1%пепсин 3%трипсин 1%трипсин 3% 40более 1381,81,61,72,0 138-10,55,45,63,24,0 10,5-5,19,510,37,86,2 60более 1382,11,81,72,1 138-10,56,35,64,24,3 10,5-5,19,811,07,86,4 120более 1382,22,32,22,1 138-10,57,111,26,26,4 10,5-5,111,918,710,310,8 240более 1381,81,91,71,7 138-10,59,516,510,44,5 10,5-5,112,918,110,910,4 Кроме того, полученные данные позволяют утверждать, что проведение гидролиза пепсином существенно эффективнее по сравнению с трипсином. Так, при одной и той же концентрации фермента (3%) низкомолекулярных пептидных фракций при гидролизе пепсином образуется в 1,7 раза больше, чем при гидролизе трипсином. Таким образом, с учетом определения молекулярно-массового распределения пептидных фракций были выбраны оптимальные технологические параметры выделения казеиновых фосфопептидов. Схема выделения включает одностадийный гидролиз казеината натрия пепсином, удаление непептидного материала, CaCl2-агрегацию и фильтрацию. Предложенная схема выделения СРРs может быть использована для разработки схем промышленного получения водного раствора казеиновых фосфопептидов с максимальным содержанием низкомолекулярных соединений. На следующем этапе исследований в питательную среду вносили различные дозы водного раствора СРРs и сульфата железа. За процессом связывания железа следили по количеству образованного хелатированного Fe2+ (% железа, оставшегося в двухвалентной форме от первоначальной дозы). Результаты исследований (средние показатели по всем изученным штаммам) представлены на рис. 1. Существует мнение, что искусственные хелатные формы минералов при хранении разрушаются и теряют свою эффективность, поэтому они уступают природным органическим солям этих элементов. В связи с этим исследовали сохранность железа, хелатированного казеиновыми фосфопептидами, в двухвалентной форме в процессе длительного хранения. Результаты исследований представлены в табл. 2. Рис. 1. Зависимость содержания в средах усвояемого (хелатированного) Fe2+ от количества водного раствора казеиновых фосфопептидов Данные, приведенные в табл. 2, указывают на то, что в процессе хранения количество хелатированного железа в концентратах, содержащих раствор СРРs, практически не изменилось. Тогда как в контроле наблюдалось значительное снижение содержания растворимых ионов Fe2+. Совокупность полученных данных указывает на то, что казеиновые фосфопептиды являются перспективными хелатирующими агентами для получения новых, биодоступных форм железа. В результате исследований подобраны оптимальные дозы FeSO4 и водного раствора СРРs, обеспечивающие максимальное количество солюбилизированного железа. Таблица 2 Влияние СРРs на процесс солюбилизации железа при хранении ШтаммСодержание СРРs, %Содержание Fe2+в среде при хранении (% от первоначальной дозы внесения), сут 306090120 P. freudenrichii subsp. fredenreichii АС-2500контроль19,019,019,518,5 1058,062,062,560,0 2088,088,088,588,0 P. cyclohexanicum Kusano АС-2260контроль30,029,530,028,5 1069,070,570,069,0 2094,595,095,094,5 P. cyclohexanicum Kusano АС-2259контроль32,032,030,529,0 1060,060,560,059,5 2075,075,075,575,0 P. fredenreichii subsp. shermanii АС-2503контроль22,025,025,519,0 1066,067,066,063,5

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авцын А., Жаворонков А., Рош М., Строчкова Л. Микроэлементозы человека. - М.: Медицина. - 2005. - 496 с.
2. Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии. - М.: Изд-во МГУ, 1999. - 300 с.
3. Гаппаров М., Стан Е. Влияние казеиновых фосфопептидов на биодоступность минералов // Вопросы питания. - 2003. - № 6. - С. 40-4.
4. Хамагаева И., Качанина Л., Тумурова С. Биотехнология заквасок пропионовокислых бактерий. - Улан-Удэ.: ВСГТУ, 2006. - 172 с.
5. Хамагаева И.С., Кривоносова А.В. Влияние сульфата железа на биохимическую активность пропионовокислых бактерий // Молочная промышленность. - 2007. - № 6. - С.33.
6. Гаппаров М.М., Стан Е.Я. Влияние казеиновых фосфопептидов на биодоступность минералов // Вопросы питания. - 2003. - № 6. - С.40-44.
7. Тутельян В.А. К вопросу коррекции дефицита микронутриентов с целью улучшения питания и здоровья детского и взрослого населения на пороге третьего тысячелетия // Ваше питание. - 2004. - № 4. - С. 25-27.
8. Berracol R., Chanson S., Juillerat M.A. et al // J. Dairy Res. - 1989. - Vol. 56. - № 3. - Р. 335-341.
9. Yoshirawa M., Sasari R., Chiba H. // Aric. Biol. Chtm. - 1981. - Vol. 45. - № 4. - Р. 909-914.
10. Sato R., Naguchi T., Naito N. // J. nutr. Sci. vitaminol. - 1986. - Vol. 32. - № 1. - Р. 67-76.
11. Schlimme E., Meisel H. // Nahrung. - 1995. - Vol. 39. - № 1. - Р. 1-20.