Аннотация

Показано влияние различных концентраций лизоцима и лактоферрина на пробиотические культуры разных таксономических групп. На основании результатов исследований обоснован состав полифункциональной биологически активной добавки, включающей пробиотические культуры, лизоцим и лактоферрин, для обогащения молочных продуктов.

Ключевые слова

Биологически активная добавка, биологически активные белки молока, лактоферрин, лизоцим, пробиотические культуры

ВВЕДЕНИЕ

Введение В распоряжении Правительства РФ № 1873-р от 25.10.2010 г. «Основы государственной политики в области здорового питания населения на период до 2020 года» отмечается, что «несмотря на положительные тенденции в питании населения, смертность от хронических болезней, развитие которых в значительной степени связано с алиментарным фактором, остается значительно выше, чем в большинстве европейских стран». Одной из основных задач государственной политики в области здорового питания населения является «развитие производства пищевых продуктов, обогащенных незаменимыми компонентами, специализированных продуктов детского питания, продуктов функционального назначения, диетических (лечебных и профилактических) пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище, в том числе для питания в организованных коллективах (трудовые, образовательные и др.)» [1]. В этой связи разработка новых продуктов с направленными функциональными свойствами, а также повышение эффективности действия существующих продуктов относится к одной из актуальных проблем современной пищевой биотехнологии. Oдним из направлений решения данной проблемы может быть применение в питании биологически активных природных комплексов. Комплексы должны мягко воздействовать на организм и повышать его сопротивляемость к негативным факторам различного характера. Среди таких соединений можно назвать биологически активные белки молока, в частности лизоцим и лактоферрин, которые являются естественными факторами защиты живых организмов и обладают целым рядом уникальных свойств, к важнейшим функциям которых относят противоинфекционную, иммуномодуляторную, противовоспалительную, антиоксидантную, регенеративную и другие. Однако технологические приемы, используемые при производстве молочных продуктов, приводят к инактивации или значительному снижению исходного содержания биологически активных веществ в сырье. В этой связи рациональное использование сырьевых ресурсов, более глубокая и полная их переработка, а также поиск новых подходов сохранения биологически активных веществ в готовой продукции являются приоритетными направлениями в науке и технологии. Для усиления функциональных свойств биологически активных белков молока было предложено изучить возможность их совместного применения с пробиотическими микроорганизмами, которые широко используются в технологии молочных продуктов. Известно, что пробиотические бактерии относят к функциональным компонентам. Это обусловлено тем, что пробиотические микроорганизмы являются естественными обитателями кишечника человека, которые способствуют нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта, а продукты их метаболизма участвуют в регулировании таких важнейших функций, как обмен веществ, укрепление иммунитета, снижение концентрации токсических веществ, улучшение общего самочувствия и др. [2, 3]. Объекты и методы исследования Объектами исследования служили пробиотические культуры из коллекции Университета Lactobacillus acidophilus AE-5 (ВКПМ В-8153), L. acidophilus ACT-41 (ВКПМ В-9644), L. acidophilus АСТ-44, новый штамм L. acidophilus 887, L. fermenum LFM-2 (ВКПМ В-10368), L. plantarum ГВИ-1 (ВКПМ-8556), L. rhamnosus LC-52GV (ВКПМ В-9475), B. ado-lescentis BGV-11 (ВКПМ Ас-1742); куриный лизоцим (Fluka Bio Chemika, Бельгия); лактоферрин (Sigma-Aldrich, США); лактоферрин, выделенный из молочного сырья; тест-культры E. coli O 147, Staph. aureus P 209. Количество клеток молочнокислых бактерий определяли по ГОСТ 10444.11-89 «Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов». Количество клеток бифидобактерий определяли согласно МУК 4.2.999-00 «Определение количества бифидобактерий в кисломолочных продуктах. Методические указания». Выделение лактоферрина осуществляли на хроматографической установке Bio-Rad Bio-Logic LP (США) с использованием сорбента Macro Prep CM-Support (США). Перевод лактоферрина в апо-форму осуществляли с помощью диализа против 0,1 М лимонной кислоты С6Н8О7 (рН = 2) («Лабтех», Россия) в течение 24 ч при t = (4±2) 0С. Избыток лимонной кислоты удаляли диализом против дистиллированной воды при t = (4±2) 0С в течение 3 ч. Антагонистическую активность по отношению к патогенным и условно-патогенным тест-микро-организмам определяли диффузионным методом и методом совместного культивирования. Диффузионный метод определения антагонистической активности заключается в том, что в зараженном тест-культурой агаре делают лунки диаметром 8 мм на расстоянии 1,5-2 см друг от друга. В полученные лунки закапывают исследуемый образец и культивируют при оптимальной для тест-микро-организма температуре. Результаты и их обсуждение В научной литературе сообщается, что лизоцим и лактоферрин в определенных дозах могут инактивировать грамотрицательные и грамположительные бактерии [4, 5], а некоторые источники сообщают об их ростостимулирующей способности на бифидобактерии и некоторые виды лактобактерий [6, 7]. Поэтому важным этапом в исследовании было изучение влияния лизоцима и лактоферрина на рост пробиотических бактерий. На первом этапе исследований было изучено влияние различных концентраций лизоцима на пробиотические культуры из коллекции Университета. Лизоцим - фермент класса гидролаз, механизм его антимикробного действия обусловлен способностью лизоцима нарушать клеточную стенку бактерий, тем самым вызывая лизис бактерий. Для более объективной оценки сочетаемости лизоцима и пробиотических культур предложено использовать турбидиметрический метод. Поэтому изучали развитие бактерий на стандартной жидкой прозрачной среде. На основании полученных данных были построены калибровочные кривые. На рис. 1 представлены некоторые из них. Влияние лизоцима на пробиотические бактерии оценивали по изменению оптической плотности и активной кислотности. В ходе исследований по влиянию лизоцима на пробиотические культуры установлено, что лизоцим в определенных дозах может оказывать отрицательное действие на развитие не только штаммов, относящихся к различным таксономическим группам пробиотических микроорганизмов, но и к одному виду (рис. 2). В результате изучения антагонистической активности модельных композиций, состоящих из штаммов пробиотических бактерий и лизоцима, в отношении патогенных и условно-патогенных тест-культур было установлено количество лизоцима, которое может применяться в сочетании с конкретными штаммами пробиотических бактерий. Именно в этом случае достигается синергетический эффект в отношении подавления развития патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Рис. 1. Калибровочные кривые на стандартной жидкой питательной среде для L. acidophilus Рис. 2. Влияние различных концентраций лизоцима на количество клеток пробиотических культур Лактоферрин - железосвязывающий гликопротеид семейства трансферринов, его молекула организована в два домена [8], каждый из которых имеет сайт связывания железа (рис. 3). Белок существует в двух формах: холо-форме (насыщенной железом) и апо-форме (железоненасыщенной), отличающихся в том числе простанственной конфигурацией. В научной литературе имеются разные сведения о механизме действия лактоферрина на микроорганизмы: некоторые ученые связывают его с насыщенностью железом [5], другие - с наличием на клеточных стенках бактерий особых лактоферринсвязывающих рецепторов [9]. Поэтому исследования по изучению взаимодействия лактоферрина и пробиотических бактерий осуществляли и с бактериями разных родов, и с разными штаммами, и с лактоферрином с различной степенью насыщенности железом. Рис. 3. Трехмерная структура коровьего лактоферрина с разрешением 2,8 ангстрем Результаты исследований влияния различных доз лактоферрина на пробиотические бактерии показали, что лактоферрин в выбранном диапазоне концентраций не оказывал отрицательного воздействия на исследованные пробиотические культуры (рис. 4). Установлено, что действие лактоферрина на пробиотические бактерии зависит от штамма и степени насыщенности лактоферрина железом. Анализ результатов исследований позволил выявить модельные системы, в которых лактоферрин оказывал ростостимулирующее действие на пробиотические бактерии. Изучение антагонистической активности модельных композиций разных штаммов пробиотических культур совместно с лактоферрином показало, что достигается синергетический эффект в отношении подавления развития патогенных и условно-патогенных тест-культур, количество которых снижалось на три порядка по сравнению с контролем. Рис. 4. Влияние лактоферрина на количество клеток пробиотических бактерий В результате комплекса проведенных исследований теоретически и экспериментально обоснован состав биологически активной добавки, а именно в ее состав предложено включить пробиотические культуры: Bifidobacterium adolescentis BGV-11 (ВКПМ Ас-1742), Lactobacillus rhamnosus LC-52GV (ВКПМ В-9475), Lactobacillus plantarum ГВИ-1 (ВКПМ-8556), Lactobacillus acidophilus ACT-41 (ВКПМ В-9644) и в установленных определенных количествах лизоцим и лактоферрин. Разработанная биологически активная добавка будет способствовать оздоровлению населения, а ее применение в технологии молочных продуктов позволит обогатить их функциональными компонентами и расширить линейку продуктов здорового питания, потребность населения в которых постоянно возрастает.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Распоряжение Правительства РФ № 1873-р от 25.10.2010 г. «Основы государственной политики в области здорового питания населения на период до 2020 года» // Российская газета. - Федеральный выпуск № 5328 от 3 ноября 2010 г.
2. Ганина, В.И. Технологические аспекты производства кисломолочного мороженого с функциональными ингредиентами / В.И. Ганина, М.А. Федотова, В.А. Обелец, А.А. Творогова // Молочная промышленность. - 2009. - № 7. - С. 63-64.
3. Ганина, В.И. Разработка ресурсосберегающей биотехнологии молокосодержащего функционального продукта / В.И. Ганина, Е.Н. Терешина, С.В. Карпычев // Молочная промышленность. - 2011. - № 5. - С. 72.
4. Толокнова, И.В. Обогащение жидких детских адаптированных кисломолочных продуктов лизоцимом: автореф. дис. - М., 1988.
5. In vitro growth responses of bifidobacteria and enteropathogenes to bovine and human lactoferrin / E.A. Griffiths [et al.] // Digestive Diseases and Sciences. - 2003. - Vol. 48. - № 7. - Р. 1324-1332.
6. Growth-promoting effects of lactoferrin on L. acidophilus and Bifidobacterium spp. / W.-S. Kim [ et al.] // BioMetals. - 2004. - № 17. - Р. 279-283.
7. Susceptibility of bifidobacteria to lysozyme as a possible selection criterion for probiotic bifidobacterial strains / V. Rada [et al.] // Biotechnology Letters. - 2010. - 32(3). - P. 451-455.
8. González-Cháveza, S.A. Lactoferrin: structure, function and applications / S.A. González-Cháveza, S. Arévalo-Gallegosa, Q. Rascón-Cruz // Int J Antimicrob Agents. - 2009. - № 33. - Р. 301. e1-8.
9. Examination of bovine lactoferrin binding to bifidobacteria / M.M. Rahman [et al.] // Prikl Biokhim Mikrobiol. - 2008. - № 44. - Р. 529-532.