Аннотация

Учитывая актуальность проблемы обеспечения продовольственного российского рынка качественными продуктами питания, в работе проведен сравнительный анализ геномов растений и микроорганизмов, используемых в производстве пищевых добавок, для выбора ДНК-мишени, которая позволит разработать методику идентификации стабилизирующих добавок растительного и животного происхождения.

Ключевые слова

Cравнительный анализ, геном, стабилизаторы, молекулярная мишень

ВВЕДЕНИЕ

Введение Молочные продукты являются важнейшим компонентом в рационе питания человека. Постоянный прирост населения, совершенствование технологий получения традиционных продуктов питания и создание новых пищевых продуктов с заданным комплексом свойств, отрыв мест производства продуктов от мест их потребления вызывают необходимость стабильного роста использования пищевых добавок в молочной промышленности. Применение стабилизаторов необходимо для создания молочных продуктов с заданными свойствами. Стабилизаторы дают возможность регулировать вязкость продуктов на разных этапах технологического процесса, который облегчает производство. С их помощью можно уменьшить температуру разлива молочного продукта, не вызывая при этом снижения вязкости конечного продукта. Они разрешают предупреждать выделение сыворотки при сохранении кисломолочных продуктов благодаря повышению влагоудерживающей способности молочно-белкового сгустка, а также достигать повышения вязкости продуктов и увеличения прочности молочно-белкового сгустка без увеличения содержимого жира, который дает возможность вырабатывать с их помощью продукты питания пониженной калорийности. Для улучшения консистенции пищевых продуктов и повышения их стойкости при сохранении часто используют стабилизирующие добавки растительного и животного происхождения [1]. Их токсикологическая оценка и гигиеническое нормирование в настоящее время актуальны во всех странах. Исследования пищевых добавок в международном масштабе начаты еще в 50-х годах ХХ в. со времени создания в 1956 г. Объединенного комитета экспертов по пищевым добавкам. Принципы проведения исследований пищевых добавок и контаминантов, содержащихся в продуктах питания, сформулированы в руководстве «Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Принципы оценки безопасности пищевых добавок и контаминантов в продуктах питания» [2]. На основании обобщения результатов исследований Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ выработал принципы проверки безопасности пищевых добавок. В 1963 г. учреждена объединенная программа ФАО/ВОЗ по пищевым стандартам. Относительно пищевых добавок было признано, что в целях охраны здоровья населения целесообразно ограничить поступление их в организм. Однако использование пищевых добавок в экономически развитых странах постоянно расширяется. И, поскольку они являются чужеродными веществами для организма человека (по химическому составу или по количеству, поступающему в организм человека с продуктами питания), это обусловливает необходимость проведения исследований и мероприятий, направленных на предупреждение их неблагоприятного влияния на здоровье человека. Большинство пищевых добавок не оказывает особого пищевого и функционального влияния на организм, некоторые из них инертны в используемых количествах. Так, в виде стабилизаторов для молочных изделий допущены агар, агароид (фурцеларан), альгинат натрия. Экспериментальные исследования токсичности указанных соединений малочисленны, но имеются сообщения о том, что у людей и животных не обнаружено признаков их неблагоприятного влияния на организм. Однако поступление указанных соединений в организм в повышенных количествах может оказывать послабляющее действие, например, агар оказывает наиболее выраженное послабляющее действие [3]. Имеется достаточно много пищевых добавок, способных оказывать неблагоприятное воздействие на организм человека при поступлении в повышенных количествах. Определение уровня их безопасности проводится на основе гигиенической регламентации. В нормативах использования пищевых добавок отражены количественные показатели, которые характеризуют их безопасные уровни. При изучении каждой пищевой добавки в токсикологическом эксперименте устанавливается ДСД (допустимая суточная доза). На основании проведенных исследований устанавливается недействующая доза добавки (или NOEL) и ДСД поступления ее в организм, которая выражается в мг/кг массы тела и, как правило, имеет коэффициент запаса, равный 100. Исходя из ДСД высчитывается максимально допустимый уровень (МДУ) присутствия пищевой добавки в каждом конкретном продукте [2]. Помимо этого, необходимо разработать, утвердить и провести метрологическую аттестацию методов идентификации и количественного определения содержания отдельной пищевой добавки в конкретных видах продукции. В химическом отношении стабилизаторы являются полисахаридами или белками. При классификации пищевых стабилизаторов могут применяться разные подходы и критерии как с точки зрения происхождения, так и способа производства. Классификация пищевых стабилизаторов довольно сложная, и потому был предложен целый ряд разных схем, например: описание всех соединений как полисахаридных материалов; наименования, которые содержит ботанический вид; происхождение - растительное, животное или синтетическое; химическая классификация. Позднее была предложена классификация, которая включает метод обработки: натуральные стабилизаторы; модифицированные натуральные или полусинтетические стабилизаторы (химические модификации натуральных стабилизаторов или подобных им веществ); синтетические камеди (полученные химическим синтезом) [4]. Кроме этого, все чаще возникает термин «стабилизационные системы», он хоть и не является общеупотребительным, но широко применяется в молочной промышленности для обозначения смесей загустителей и гелеобразователей, качественный и количественный состав которых специально подобран для производства различных молочных продуктов [5]. Таким образом, проблема разработки методов идентификации и количественной оценки содержания стабилизаторов в продуктах молочной промышленности является актуальной и очень сложной задачей. Объекты и методы исследований Прогресс в расшифровке различных геномов открывает для исследователей возможность использования электронных международных геномных баз [6]. Большой практический интерес представляет их использование при поиске новых молекулярных мишеней для вновь создаваемых высокочувствительных ДНК-методов оценки качества и экспертизы растительного сырья для пищевых добавок и молочных продуктов питания на их основе. Актуальность создания новых методик неоспорима, поскольку используемые в настоящее время методы органолептического и физико-химического анализа не позволяют однозначно идентифицировать и оценить количественно содержание стабилизаторов в готовых продуктах питания. Несмотря на то что использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для видовой идентификации тканей животного и растительного происхождения получило высокую оценку зарубежных специалистов, в нашей стране это направление не нашло еще широкого практического применения в области санитарной экспертизы [7]. Первоочередной задачей является выбор презентативных ДНК-мишеней, на основе которых возможно конструирование олигонуклеотидных праймеров для дифференциальной амплификации специфических последовательностей ДНК. Нами были выбраны следующие требования, предъявляемые к ДНК-мишени: биологические (мишень должна присутствовать во всех целевых видах организма, видовые отличия мишени должны быть возможно меньшими, а родовые как можно большими, отсутствие резистентности у целевых видов микроорганизмов, отсутствие мутаций мишени); технологические (мишень должна быть детально изученным объектом, структура мишени при технологической обработке в процессе приготовления продуктов питания должна быть постоянной). В качестве объектов исследования были выбраны нуклеотидные последовательности организмов, участвующих в производстве стабилизаторов. Объекты представлены в табл. 1. Таблица 1 Источники и ботанический вид стабилизаторов растительного и животного происхождения Название стабилизатораИсточникБотанический вид Гуаровая камедьРастениеCyamopsis tetraganoloba Камедь рожкового дереваРастениеAcacia Mill. ГуммиарабикРастениеAcacia senegal ТрагакантРастениеAstragalus Ксанта́новая каме́дьБактерии Xanthomonas campestris Агар-агарВодоросли Gracilaria, Gelidium, Ceramium и др. Альгинат натрияВодорослиLaminaria cichoriocides, Laminaria japonica Поиск нуклеотидных последовательностей геномов проводили по базам данных GeneBank - Национального института здоровья США (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), EMBL - Европейской молекулярно-биологической лаборатории (), DDBJ - Национального института генетики Японии при помощи поисковой системы Entrez Национального центра биотехнологической информации США. Сравнение нуклеотидных последовательностей геномов растений с помощью программы парного выравнивания ClustalW Multi Sequnce Alignment позволило сократить количество известных нуклеотидных последовательностей (в силу выравнивания последовательности расходящихся последовательностей) с нескольких тысяч для каждого объекта до десятков. Анализ нуклеотидных последовательностей на вариабельность проводили online. Построение филогенетического дерева проводили с помощью программы AliBee, ресурса Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ) www.belozersky.msu.ru. Результаты и их обсуждение Филогенетические связи между всеми живыми организмами могут быть прослежены путем сравнения последовательностей генов и отдельных участков генов, кодирующих рибосомальные РНК. Данные полностью либо частично секвенированных генов рРНК различных видов организмов поступают в международные базы данных и доступны через компьютерную сеть. Большинство из стабилизаторов, выбранных для исследования, производятся из сырья растительного происхождения. Геном хлоропласта является уникальным для растений. В растительной клетке он представлен большим количеством копий, переменных и некодируемых областей (интроны и межгенные области), что делает данный геном очень чувствительным к родовой и видовой идентификации растительного сырья в объектах [10]. Наибольшее распространение для таксонометрических исследований в подобных случаях получил ген 5,8S рРНК. 5S-рРНК область является компонентом всех рибосом, кроме митохондрий определенных видов растений. Во всех высших эукариотах 5S-РНК транскрибируется от сотен до тысяч генов. Гены, кодирующие 5S-рРНК, расположены отдельно от 18S-26S рРНК кластеров генов и организованы в виде тандемных повторов с альтернативными массивами кодирования последовательностей 5S-РНК, и транскрибирующими спейсерами (ITS) по одному или несколько сайтов в геноме [11]. Кластеры генов могут быть локализованы как в связанном состоянии и, следовательно, не располагаться в хромосоме или самостоятельно в геноме. У высших эукариот 5S-рРНК гены организованы в виде тандемных повторов, 200-900 б.п. длиной, с 1000- 50 000 копий [12]. Сам ген состоит из 120 п.н. и связан со спейсерами различных размеров. Последовательность 120 п.н. 5S-рРНК сохраняется внутри рода, а ITS области кластеров изменяются от вида к виду и имеют различную длину в диапазоне от 100 до 800 п.н. [11], так как они, видимо, находятся не под жестким давлением отбора в кодирующей области. Гуаровая камедь и трагакант производятся из растений, относящихся к различным семействам, поэтому для их идентификации будет достаточно использовать родоспецифичные участки, за которые отвечает 5,8S рРНК ген. Нуклеотидная последовательность гена 5,8S рРНК для Cyamopsis tetraganoloba : cgcgtcgttg ccctaactcg gacgtctcat ttggtgtcgt tgagtggcga atgttggctt cccacgagcg ttgcctcatg gttggttgaa attcgagtcc gtggtggagg atgccacgat tgatatggtg gttgagtaat tagctcgaga cccatcgtga gcgactccat cttgttttgg actctttgac ccacatgagc atctccgatg ctcgttacg. Нуклеотидная последовательность для Astragalus: tcggcggtgg tgccttgtca catgatacag aatgactctc ggcaacggat atctaggctc ttgcatcgat gaagaacgta gcgaaatgcg atacttggtg tgaattgcag aatcccgtga. В случае гуммиарабика и камеди рожкового дерева, а они производятся из растений, относящихся к одному роду - род Acacia, необходимо использовать кластер ITS1-5,8S рРНК-ITS2, где ITS1 и ITS2 - это транскрибируемые спейсеры. Нуклеотидная последовательность кластера ITS1-5,8S рРНК-ITS2 для Acacia senegal: gagcgacccg cggaccggtt ggatatcgtg ccccagcgtg gggggcgacg gccctcgcgc ccgaggcctc ccccgccaac caaaccccgg cgccgcaggc gccaaggaaa cgtaacagag cagtggcgac gccggccggc ggcccgggaa cggcgccgca cgccggccca cgccgaacgc gaaccgaaac gactctcggc aacggatatc tcggctctcg catcgatgaa gaacgtagcg aaatgcgata cttggtgtga attgcagaat cccgtgaacc atcgagtctt tgaacgcaag ttgcgcccga agccgtctgg ccgagggcac gtctgcctgg gcgtcacgca ccgtcgccac cgccccaccc cgggcgcggc ggaggatggc ctcccgggag ccccgcctcc cggctggccg aaatgggggc ccgacttgac ggccgccacg gtccacggtg gctgagcgga cacgcgctcg agaccaagac gtgcgcgggc cgtccgagga gagggcccgt cggcgagggc agcgccctcc acaacccgac gcgacctc. Для Acacia Mill. - ggcggttcgc tgccggcgac gtcgcgagaa gtccactgaa ccttatcatt tagaggaagg agaagtcgta acaaggtttc cgtaggtgaa cctgcggaag gatcattgtc gcgtccacgc aaaragagcg acccgcgaac cggttggaac gatccccacg agcgggggag ggcgagggcg cgcccgaggc ctcccccggc aaccaaaccc cggcgcccca ggcgccaagg aacagagaay gaaagcgggg cgcgcccgct ggcggcccgg gaacggagcc gatcgcccag cgtcgcgcgc ctcttgccat ttgtgcatcc gaaacgactc tcggcaacgg atatctcggc tctcgcatcg atgaagaacg tagcgaaatg cgatacttgg tgtgaattgc agaatcccgt gaaccatcga gtctttgaac gcaagttgcg cccgaagccg tcaggccgag ggcacgcctg cctgggcgtc acgcagcgtc gccaacgccc gatcccacgg gcgcggcgga tgatggcctc ccgggagcct cgccycccgg ctggccgaaa agggggccca acgtggcgac cgccacgatc cacggtggtt gagcgagcac tcgcgccagg ccgagacgtg cgcgcgtcgt cccaccggtc ttgggcccgc cggcagggca ccacggctgc caagcccgta cgcgacccca ggtcaggcgg ggctacccgc tgagttaagc atatcaataa g. Ситуация осложняется при анализе таких стабилизаторов, как агар-агар и альгинат натрия, они производятся из бурых водорослей. Классификация бурых водорослей неоднозначна, и существует несколько систем классификаций, например, система классификации в соответствии с Saunders and Hommersand (2004) и система классификации в соответствии с Hwan Su Yoon et al. (2006). Для оценки межвидовых отношений было проведено построение филогенетического дерева, оно приведено на рис. 1. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что водоросли, используемые для производства стабилизаторов в промышленных масштабах, относятся к различным семействам и даже порядкам. Это свидетельствует о том, что в качестве ДНК-мишени будет достаточно использовать ген 5,8S-рРНК. В случае агар-агара, когда возможно использование сразу трех видов водослей, относящихся к различным порядкам, необходимо создать систему, позволяющую одновременно идентифицировать присутствие любого из объектов. Необходимо создать систему, содержащую праймеры ко всем нуклеотидным последовательностям гена 5,8S рРНК различных видов водорослей. Рис. 1. Филогенетическое дерево, основанное на анализе структур ITS1-5,8S рРНК-ITS2, отражающее родственные связи исследуемых видов бурых водорослей Нуклеотидные последовательности гена 5,8S рРНК, выбранные для дальнейшей работы над идентификацией агар-агара: 1) acaaattgga ctttggcatt ctgcattatg tgtgctcaga tgatgcactt gttttttgaa aaattaataa ggacatggtc tttgagctct tttgcaataa gagtgccgct gatgggtgcg tccttacgac ttgtaatgaa aattacaaga tgtggggtca cctgaagaat acttgggtgt gtacagcgtt gccttgaaat aaattgaaaa aactcgtttt tttctgtttt tttctgaaag taatgtgtac aaggaataaa accgtgtttt cattctcttc ttcgaagact tgagttgtat cttttttttt tttcccttcc gggaaagaca aaaaagaact catgttgggt gaaagctcgc aattttaatt tccgacagaa cttgagaacc ttgactcgag ttcttgtggc gacccggctg cgaattggtg ttttgatgta aaagtcgcac aacatttctg cagtggttta agacgcttaa caagaatata ccaaatcgaa tcaagatagt tatcgttcta tcgtcgagat aattgctgga gagctaagaa gtaggagtga tgaccataaa aacaatgctt ttttgttttt gttttggggc gttttattgc ttgtttgtgc cgacatccat attatggggg ggttttttgt ttgcagaaaa gaaaagcaga aaggatcgna tatttattga aaatttctgg gattttttgt ctg; 2) tccgcacaaa actcaatctt attcagtttt tgaaaccttt tggtttaaaa aaactgaata gctgatgggc gtagatttca ttatctttag tccatgaatt cttttagaat ttatggtcgc ctgaagagta gagcgctgat aaaattttga acctttttgg ttatttatta agaatgatgt gcaatattcg tattgacatt aattcatatt ttgaagcgtt acgaagtaat attatttttc tcgaatgttt caaaatggag ttagtggaaa cagaaatcta gatgaatatc cagaaaacat aggtactgtt tattattgct aaataaaata caattttttt ggatctcaaa tcaga; 3) aaacgtaatg cgatttgcag aactcgtgaa tcatcgaatt tttgaacgca agtggcgctc gcgggaaatc ctgcgagcat gtctgtttga gtgtcccttg gtaaaaaaca ctaaaacatc tgtttttaat cagatttatt ttgccgtctt tcgtgtttca tttacttgaa gcacggggga tggcagctgt tgggtgcgtc cttgctagat gtttttttat ctggtggggt caccttaaat ttagtgcacc attggagggc atcgtctcaa aacacggaat tactttttaa ttcacctgcc gagcaattat tgttgataat ttgtgtttta cgcattctat cacgtctccg agatgacatg cttgcatgaa gtctggggag gaaatacggt gtggcgtgtg tgccttttgg gggtcctgac gaagtactaa gatcttattt tataatttct ttttttcttt gcggcattct caacacatgc agccaagcaa attttctttc tggaattaga gtctgttaaa ttgtcgagga atttttgttt tgacttgtgn tgtacaaatt gttttttatt ttgatttgat gtgatttctc gtggggtaaa atgtatttca tttatttgga aac. Нуклеотидные последовательности кластера ITS1-5,8S рРНК-ITS2 для Laminaria cichoriocides и Laminaria japonica до сих пор не просеквенированы, поэтому для анализа использовали последовательности других видов рода Ламинариевые. Возможность проведения таких испытаний была доказана сравнением нуклеотидных последовательностей геномов всех депонированных видов данного семейства с помощью программы парного выравнивания ClustalW Multi Sequnce Alignment. Таким образом, была получена следующая нуклеотидная последовательность гена 5,8 S рРНК для идентификации альгината натрия: tgttgac accactcgcc ccctctccct cccccgtgaa aagggttggg aggcggggcg gactctgagt gttccggagt tcccatgctc cgagtgcacc taatctcgtg aacgaagcct ctcgcgccct gccgcacaga gttgttgacg gcgctcgctt cggcggcgac tctcgactcg ccaaacgtgc gcaggctgcg gggcttcttc cggcgctcct cgagaagggt gtaaaaaccc tctcttcgtg gaaaccgtac cactttcgtt cg. Из выбранных для исследования стабилизаторов только ксантановая камедь производится из источника животного происхождения - бактерии Xanthomonas campestris. Особенно широко в таксономических исследованиях у бактерий используются последовательности генов малой (16S) субъединицы рРНК, которая, как меньшая по величине, имеет менее протяженный и потому менее изменчивый ген по сравнению с большой (23S) субъединицей. Использование в качестве ДНК-мишени данного гена отвечает всем необходимым требованиям. Нуклеотидная последовательность, выбранная из баз данных для последующей работы: cctcctttga gcatgacgtt attcgtcctg tcgggcgtcc tcacaaatta cctgcattca gagattcata ccggcacagg tcggtatgcg aagtcccttt tggggcctta gctcagctgg gagagcacct gctttgcaag cagggggtcg tcggttcgat cccgacaggc tccaccatat tgagtgaaaa gacttcgggt ctgtagctca ggtggttaga gcgcacccct gataagggtg aggtcggtag ttcgagtcta cccagaccca ccactctgaa tgtagtgcac acttaagaat ttatatggat cagcgttgag gctgagacat gttcttttat aacttgtgac gtagcgagcg tttgagatat ctatctaaac gtgtcgttga ggctaaggcg gggacttcga gtccctaaat aattgagtcg tatgttcgcg ttggtggctt tgtaccccac acaacacggc atgtaactcc gaggcaactt ggggttatat ggtcaagcga ataagcgcac acggtgg. В результате исследований проведен сравнительный анализ геномов организмов, используемых в производстве пищевых добавок, произведен выбор презентативных ДНК-мишеней для проведения полимеразной цепной реакции в случае родовой и видовой идентификации различных видов стабилизаторов. Полученные данные имеют огромное значение в процессе разработки новой методики идентификации и количественной оценки определенных пищевых добавок.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Залашко, М.В. Биотехнология переработки молочной сыворотки / М.В. Залашко. - М.: Агропромиздат, 1990. - 192 с.
2. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Принципы оценки безопасности пищевых добавок и контаминантов в продуктах питания. - ВОЗ, Женева, 1991. - 159 с.
3. Габович, Р.Д. Гигиенические основы охраны продуктов питания от вредных химических веществ / Р.Д. Габович, Л.С. Припутина. - Киев: Здоров'я, 1987. - С. 199-237.
4. Зобкова, З.С. Пищевые вещества, формирующие консистенцию и новые свойства молочных продуктов / З.С. Зобкова, Т.П. Фурсова // Молочная промышленность. - 2007. - № 10.- С. 18-19.
5. Сарафанова, Л.А. Применение пищевых добавок в молочной промышленности. - СПб.: Профессия, 2007. - 262 с.
6. Дубанов, А.В. Компьютерный поиск новых мишеней для действия противомикробных средств на основе сравнительного анализа геномов / А.В. Дубанов, А.С. Иванов, А.И. Арчаков // Вопросы медицинской химии. - 2001. - № 3. - С. 54-60.
7. Обухов, И.Л. Применение ПЦР в ветеринарии // Аграрная Россия.- 2002.- № 5.- С. 62-64.
8. Rossen, L. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic asssays and DNA extraction solutions / L. Rossen, P. Norskov, K. Holmstrom, O.F. Rasmussen // Int. J. Food Microbiol. - 1992. - № 17. - P. 37-45.
9. Woolfe, M. Food forensics: using DNA technology to combat misdescription and fraud / M. Woolfe, S. Promrose // Trends Biotechnol. - 2004. - № 22. - Р. 222-227.
10. Delano, J. Use of an intron region of a chloroplast tRNA gene (trnL) as a target for PCR identification of specific food crops including sources of potential allergens / J. Delano, A. Schmidt // Food Research International. - 2004. - № 37. - Р. 395-402.
11. Hunter, D.C. Fruit-based functional foods II: the process for identifying potential ingredients / D.C. Hunter, J. Zhang, L.M. Stevenson, M.A. Skinner // Int. J. Food Sci. Technol. - 2008. - № 43. - Р. 2123-2129.
12. Gnavi, G. Maffei PCR, sequencing and PCR-RFLP of the 5S-rRNA-NTS region as a tool for the DNA fingerprinting of medicinal and aromatic plants / G. Gnavi, M. Cinzia, M. Berteaa, E. Massimo // Flavour Fragr. J. - 2010. - № 25. - Р. 132-137.