Аннотация

Изучена кинетика деструкции гистидина с помощью L-гистидин-аммоний-лиазы и разработана технология удаления продуктов его биотрансформации (аммиака и уроканиновой кислоты) из гидролизатов казеина, что определяет их дальнейшее использование в качестве молочного белкового эквивалента для производства функциональных продуктов, предназначенных для питания больных гистидинемией.

Ключевые слова

Биотрансформация гистидина, L-гистидин-аммоний-лиаза, удаление аммиака, уроканиновая кислота, гистидинемия

ВВЕДЕНИЕ

Введение В настоящее время описано более 600 видов наследственных нарушений обмена. При развитии этих заболеваний поражение центральной нервной системы приводит к возникновению так называемого сложного дефекта, т. е. к различным сочетаниям интеллектуальной недостаточности с поражениями двигательной системы, недоразвитием речи, нару-шениями зрения, слуха, эмоционально-поведенчес-кими расстройствами и судорожными припадками [1]. Наследственные нарушения обмена веществ обусловлены мутациями-изменениями последовательности нуклеотидов ДНК. Мутации приводят к синтезу дефектных белков (в том числе структурных белков, ферментов, гормонов, факторов роста, белков-рецепторов). В частности, если мутация затрагивает ген, кодирующий фермент, то последний частично или полностью утрачивает каталитическую активность [2]. Подавляющее большинство наследственных нарушений метаболизма обусловлено генетическими дефектами ферментов, участвующих в обмене аминокислот, углеводов и липидов. Патогенез и клинические проявления определяются отсутствием промежуточных или конечных нормальных метаболитов и накоплением токсических метаболитов. Клиническая картина в значительной мере зависит от степени проявления (экспрессивности) мутантного гена, а также от других генетических факторов и условий окружающей среды. Самые частые и тяжелые последствия биохимических дефектов у большинства больных людей- умственная отсталость и неврологические расстройства [3]. На данный момент в России активно начали выявлять среди новорожденных детей такое заболевание, как гистидинемия, которое оказывается врожденным нарушением аминокислотного обмена. Гистидинемия - это наследственное заболевание, связанное с нарушением обмена аминокислоты гистидина. В основе заболевания лежит врожденный дефект фермента гистидин-аммиак-лиазы класса лиаз (КФ 4.3.1.3, ген HAL, 12q22-q23), катализирующий дезаминирование L-гистидина с образованием уроканиновой кислоты и аммиака. Гистидин(L-α-амино-β-имидазолилпро-пионовая кислота) - незаменимая аминокислота, которая обязательно должна входить в состав продуктов питания для детей раннего возраста. Также она является составной частью активного центра ферментов и источником образования гистамина в организме человека. В результате метаболического блока происходит значительное накопление в тканях и жидкостях больного организма гистидина и продуктов его аномального метаболизма (имидазолпировиноградной, имидазолмолочной, имидазолуксусной кислот), оказывающих токсическое воздействие на центральную нервную систему [4]. Сегодня единственным эффективным методом лечения гистидинемии является диетотерапия, при которойосновной принцип лечебного питания заключается в ограничении поступления гистидина с пищей в тех пределах, в которых назначенная диета наиболее адекватна особенностям метаболических процессов больного организма. Цель данногоисследованиясостояла в изучении и разработке технологии биотрансформации гистидина в гидролизатах белков молока с использованием L-гистидин-аммоний-лиазы и создании технологии молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания. Объекты и методы исследования В качестве материала исследования использовали гидролизат казеина, полученный в процессе гидролиза воздействием ферментативной системой на молочный белок, состоящей из экзо- и эндопептидаз термолизина, карбоксипептидазы А и лейцинаминопептидазы при температуре (50±1)°С, фермент-субстратном соотношении 1:50 и продолжительности процесса (8±0,05) ч.; L-гистидин-аммоний-лиазу 8,6 ед./мг белка (фирма Sigma), натрий лимоннокислый трехзамещенный 5,5-водный пищевой по ГОСТ 31227-2004; воду питьевую по ГОСТ 2874.Остальные использованные отечественные и импортные реактивы имели степень чистоты не ниже х.ч. Отбор проб и подготовку их к анализу проводили по ГОСТ 26809 «Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу». Биотрансформацию гистидина проводили с помощью статического метода в термостате с перемешиванием при температуре (30±2)°С и рН (9±0,01) (фосфатный буфер). Данная температура и рН являются оптимальными для используемых L-гистидин-аммоний-лиазы в соответствии со сведениями в литературе[5],а также согласно рекомендациям фирм-изготовителей. Биотрансформацию вели при продолжительности 2-8 ч, соотношение концентрации белка фермента к концентрации белка субстрата было равно 1:25, 1:50 и 1:100. По окончании процесса ферментный препарат в составе гидролизата инактивировали нагреванием при температуре 90-95оС в течение 5-10 мин. Определение аммиака и уроканиновой кислоты проводили с помощью системы капиллярного электрофореза КАПЕЛЬ 105 по методике, разработанной в научно-образовательном центре при ФГБОУ ВПО «КемТИПП». Удаление аммиака проводили с помощью ротационного испарителя ИР-1ЛТ, предназначенного для проведения работ, связанных с быстрым удалением растворителей из растворов или суспензий органических и неорганических соединений путем пленочного испарения при нормальном или пониженном давлении и контролируемой температуре [6]. Результаты и их обсуждение В ходе исследований изучена кинетика процесса биотрансформации гистидина в белковых гидролизатах в условиях регуляции скорости с помощью различных физико-химических факторов. На рис. 1 представлена зависимость скорости реакции биотрансформации от концентрации гистидина. Рис. 1. Кривая зависимости скорости реакции от концентрации гистидина В результате анализа данных, представленных на рис. 1, сделали вывод о том, что зависимость скорости реакции биотрансформации от концентрации субстрата описывается классической гиперболической кривой. Характер подобной зависимости изучали при различных концентрациях субстрата от 300 до 9000 ммоль. Из графика видно, что при низких значениях субстрата скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата. Однако при достижении концентрации гистидина 5000 ммоль она получает свое максимальное значение. Видимо, при данной концентрации субстрата весь фермент оказывается насыщенным им и концентрация фермент-субстратного комплекса ЕS становится равной концентрации фермента. При более высокой концентрации субстрата интенсивность гидролиза остается постоянной, что, очевидно, обусловлено субстратным ингибированием. Полученные данные проанализировали с помощью метода линеаризации уравнения Михаэлиса - Ментен по Лайнуиверу - Берку и представлены на рис. 2. Методом наименьших квадратов определяли tg угла наклона, численно равный 1/Vm, а точка пересечения экстраполированной прямой с осью ординат соответствует Кm /Vm; точка пересечения с осью абсцисс -Кm. Рис. 2. Графическое определение максимальной скорости ферментативной реакции и константы Михаэлиса методом Лайнуивера - Берка В процессе исследований установлена константа Михаэлиса, численное значение которой составило 1745 мкмоль. При этом максимальная скорость процесса биотрансформации составила 1,25 мкмоль/мин. Похожие данные получены и другими учеными в результате изучения действия L-гистидин-аммоний-лиазы в модельных условиях и составили Кm = 1751 мкмоль, Vm=1,15.Известно, что Кm может несколько варьировать в зависимости от соотношения изоформ гистидина, вида буфера и присутствия в реакционной среде регуляторов ферментативной активности [7]. Дальнейшие исследования были направлены на изучение накопления продуктов реакции в процессе биотрансформации гистидина под действиемL-гистидин-аммоний-лиазы при найденных параметрах реакции: Кm = 1751 мкмоль,Vm=1,15. Известно, что оптимальными параметрами работы L-гистидин-аммоний-лиазы является температура (30±1) °С и рН 8,5. В связи с этим изучена динамика накопления аммиака и уроканиновой кислоты в процессе реакции (λ= 254 нм; тетраборатный буфер рН=9,2; напряжение = 25кВ). Результаты данных, полученных в ходе исследования, представлены на рис. 3. а) б) в) Рис. 3. Динамика накопления аммиака и уроканиновой кислоты в процессе биотрансформации гистидина под действиемL-гистидина-аммоний-лиазы в течение: а) (2±0,05) ч; б) (4±0,05) ч; в) (8±0,05) ч; 1 - гистидин; 2 - аммиак; 3 -уроканиновая кислота В результате анализа данных, представленных на рис. 3, можно сделать вывод о том, что в процессе биотрансформации происходит интенсивное накопление аммиака и уроканиновой кислоты, что свидетельствует о превращении гистидина под действием L-гистидин-аммоний-лиазы в продукты реакции. Так, массовая доля гистидина за (2±0,05) ч составила 71,3% от первоначального значения, за (4±0,05) ч - 32,06%, а при (8±0,05) ч достигает своего минимального значения. Аминокислотный состав полученных гидролизатов представлен в табл. 1. Таблица 1 Аминокислотный состав гидролизатов казеина, полученный в результате биотрансформации L-гистидин-аммоний-лиазы Аминокислоты г /100 гКазеин*Гидролизат Незаменимые, всего, в том числе:40,3225,29 Валин5,360 Изолейцин6,154,8 Лейцин11,6610,61 Лизин8,94,69 Метионин3,33,39 Треонин4,271,8 Триптофан0,680 Фенилаланин5,80 Заменимые, всего, в том числе:59,6833,75 Аланин5,393,7 Аргинин4,453,42 Аспарагиновая кислота3,331,62 Гистидин3,332,8 Глицин2,420,92 Глутаминовая кислота14,597,83 Пролин12,974,2 Серин3,841,02 Тирозин7,567,04 Цистеин1,81,2 Всего10059,04 * Приведены результаты собственных исследований. Следует отметить, чтов проведенных экспериментах, в результате высокоспецифичного действия L-гистидин-аммоний-лиазы происходит образование метаболитов: аммиака и уроканиновой кислоты. Аммиак,будучиконечным продуктом азотистого обмена в организме человека и животных, является высокотоксичным соединением. Поэтому концентрация аммиака должна сохраняться на низком уровне (в норме уровень его не превышает 60 мкмоль/л). В связи с этим была разработана технология удаления продуктов биотрансформации из полученных гидролизатов. Удаление из полученных гидролизатов казеина побочных продуктов биотрансфорации гистидина (аммиака и уроканиновой кислоты) позволили привести разработанную технологию в соответствие с требованиями, предъявляемыми к продуктам без гистидина или с низким его содержанием [8]. Очистку гидролизата проводили в два этапа. На первом этапе осуществляли удаление аммиака. Из научной литературы известно, что аммиак является бесцветным газом с резким характерным запахом, почти вдвое легче воздуха, хорошо растворим в воде. При повышении температуры растворимость аммиака падает и он испаряется. В связи с этим предпринята попытка определения оптимальных параметров удаления аммиака путем варьирования параметрами технологического процесса: температурой и продолжительностью при давлении 0,75 МПа. Результаты полученных исследований представлены на рис. 4. Рис. 4. Динамика удаления аммиака в процессе очистки: 1 - при (60±5)°С; 2 - при (70±5)°С; 3 - при (80±5)°С В результате анализа данных можно сделать вывод о том, что при температуре (60±5) °С массовая доля аммиака уменьшается на 76,5%, при (70±5)°С- на 89,5%, что не обеспечивает достаточно полного удаления аммиака и не позволяет использовать данные параметры очистки при разработке технологии молочного белкового эквивалента для функциональных продуктов питания специального назначения, соответствующего требованиям действующих стандартов [8]. Однако при температуре (80±5) °С и продолжительности процесса 90 мин наблюдается полное удаление аммиака из реакционной смеси. На втором этапе проводили очистку полученных гидролизатов от уроканиновой кислоты. Удаление уроканиновой кислоты из растворов проводили путем осаждения при низкой температуре. Поэтому дальнейшие исследования были направлены на подбор условий для максимального удаления уроканиновой кислоты: температуры и продолжительности обработки. Результаты полученных исследований представлены на рис. 5. Рис. 5. Динамика удаления уроканиновой кислоты в процессе очистки: 1 - при температуре (60±5)°С; 2 - при температуре (70±5)°С; 3 - при температуре (80±5)°С В результате анализа данных можно сделать вывод о том, что оптимальными условиями для удаления уроканиновой кислоты являются:температура (0±5) °С, продолжительность процесса (90±1) мин. Спектры поглощения аммиака и уроканиновой кислоты до и после очистки представлены на рис. 6. а а б б Рис. 6. Спектр поглощения: 1 - аммиака; 2 - уроканиновой кислоты;а) до очистки; б) после очистки В табл. 2 представлено содержание продуктов биотрансформации в полученных гидролизатах. Таблица 2 Содержание аммиака и уроканиновой кислоты до и после очистки НаименованиеЗначение, мг/100 г До очисткиПосле очистки Аммиак3,27±0,050,001±0,0001 Уроканиновая кислота5,64±0,030,001±0,0001 В результате анализа данных, представленных в табл. 2, можно сделать вывод о том, что подобранные параметры очистки полученных гидролизатов от продуктов биотрансформации гистидина обеспечивают их полное удаление из реакционной смеси и позволяют использовать полученные гидролизаты в качестве молочного белкового эквивалента при производстве специализированных продуктов, предназначенных для больных гистидинемией. Дальнейшие исследования направлены на разработку технологии молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов питания, предназначенных для больных гистидинемией.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Просеков, А.Ю. Анализ состава и свойств белков молока с целью использования в различных отраслях пищевой промышленности / А.Ю. Просеков, М.Г. Курбанова // Техника и технология пищевых производств. - 2009. - № 4. - С. 68-71.
2. Бабаич, О.О. Биологически активные пептиды из белков молока / О.О. Бабич, О.В. Козлова, И.С. Разумникова, А.Ю. Просеков // Молочная промышленность.- 2010. - №9.- С. 68-69.
3. Шабалов, Н.П. Детские болезни: учебник. В двух томах. Т. 2. - 5-е изд. - СПб: Питер, 2002. - 736 с.
4. Диетотерапия наследственных нарушений аминокислотного обмена / Е.П. Рыбакова, Т.В. Бушуева, К.С. Ладодо и др. // Вопросы детской диетологии. - 2005. -Т.3. - №1. - С.11-17.
5. Диксон, М. Ферменты. В трех томах. Т.1 / М. Диксон, Э.Уэбб; пер. с англ. - М.: Мир, 1982. - 392 с.
6. Патент (Европа) № 0,610,411,B1(1994). Casein hydrolysate and method for production of such casein hydrolysate / Nielsen P.M.
7. ПатентСША № 4600588 (1986). Milk protein hydrolysate and process of preparation / Ernster J.H.
8. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.1078-01. - М.: Минздрав РФ, 2002. - 164 с.